pcr检测法测定马铃薯黑胫病菌的标准

　　上海千实精密机电科技有限公司行业资讯：近日，一项由中国检验检疫科学研究院、上海海关、广州海关技术中心联合起草的《马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法》已经编制完成，现正面向社会公开征求意见。

　　据了解，为了制定出切实可行的标准，在标准研制之初，标准起草小组就收集和整理了大量有关马铃薯黑胫病菌的文献资料，包括病菌的分布、寄主、生物学特性、风险分析、检测方法和新研究进展等。实验室在该病菌正式命名之前就已经分离到了菌株，后期又收集到了同属的其他种菌株，这为此后的分子检测方法建立以及实际应用等信息数据为《马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法》的制定奠定了坚实的基础。

　　《马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法》是一项适用于进出境种球、花卉和种苗等植物繁殖材料中马铃薯黑胫病菌的检疫鉴定以及马铃薯黑胫病的田间调查与监测的标准。标准也详细规定了马铃薯黑胫病菌的检测和鉴定方法，其原理是寄主感病后症状特点明显，茎基部和薯块感染后出现变色和软腐，可以取样有症组织进行pcr初检后分离，或按照细菌常规分离方法分离目的菌，随后根据被害症状、菌落形态特征、Biolog测试结果、烟草过敏性反应、致病性测试以及分子生物学检测等进行病菌的分离、检测和鉴定，需要用到的仪器设备有超净工作台、培养箱、冰箱、高压灭菌锅、水浴锅、离心机、pcr仪、实时荧光pcr仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子天平、涡旋振荡器和移液器等。

　　征求意见稿中还明确规定了病菌分离的步骤和流程：取症状组织病健交界处组织少许，70%酒精表面消毒30s，灭菌水洗3次后转入1mL灭菌水中，浸泡15min，取组织浸出液在营养琼脂培养基NA平板上划线分离，也可将浸出液稀释10倍、100倍和1000倍后分别取100μL涂布NA平板，28℃下培养2-4d后挑取疑似菌落，纯化三次后用于后续试验。典型菌落淡黄色，煎蛋状，中央突起，边缘不规则。

　　此外，标准中采用的常规PCR检测方法和实时荧光检测方法均未正式发表，但是已经在口岸进行了6年的测试，包括测试了引进的阳性对照菌株和分离鉴定的菌株以及同属下的所有不同种，均未发现有假阳性扩增，并且对比测试了此前文献报道的检测方法，测试结果显示文献报道的引物ds-f/ds-r和探针ds-p可以扩增除Dickeya solani以外的其他部分种。